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摘要 目的:筛选表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素(HA)重组蛋白。方法:以A/MINNESOTA/41/2019(H3N2)毒株的HA为基础,将HA胞外区N端融合GP67信号肽,C端融合三聚化基序,分别构建HA胞外区全长及近膜区截短2个氨基酸的HA重组杆状病毒,并构建相应的不含三聚化基序的HA重组杆状病毒;经昆虫细胞表达,Western blot鉴定,亲和层析纯化后分析重组蛋白的血凝效价及稳定性。结果:四种HA重组蛋白均获得有效表达,其中HA胞外区全长融合三聚化基序的重组蛋白(HA-T)表达水平最高,经Strep tag亲和层析获得高度纯化,产量高达30 mg/L,Ethylene glycolbis交联分析显示为稳定的HA三聚体形式,血凝活性分析显示HA-T的活性最高,血凝效价为29,动态光散射显示HA-T在4℃放置3个月性质稳定。结论:HA-T表达量高、稳定性好、血凝活性高且易于纯化,研究结果为流感重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考。 相似文献
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为探究Ash2l(absent, small, or homeotic 2-like, Ash2l)对小鼠大脑皮质神经祖细胞(neural progenitor cells, NPCs)的增殖能力和细胞周期的影响。本研究利用NPCs标志物PAX6和TBR2,检测NPCs数量和分布的改变情况。结果显示,Ash2l敲除导致NPCs数量显著减少(P<0.05),且分布紊乱。对E16.5小鼠进行在体30 min EdU标记实验,检测NPCs 增殖能力,Ash2l敲除导致30 min EdU几乎无法进入NPCs(P<0.001)。结果表示,NPCs增殖能力受到严重的影响。用细胞周期M期标志物pH3,检测大脑皮质中处于M期的NPCs分布情况,同时提取了E16.5小鼠大脑皮质蛋白质,检测细胞周期蛋白 A的表达量。Ash2l敲除的NPCs的 M期细胞核分布紊乱,G2期标志蛋白质细胞周期蛋白 A表达量减少。利用EdU和BrdU双标记法,计算NPCs的S期长度。Ash2l敲除后的NPCs的S期长度缩短(P<0.05)。因此,Ash2l调控NPCs细胞周期进程,进而影响NPCs的增殖能力,敲除小鼠大脑皮质发育异常。本研究强调了表观遗传调控对胚胎期神经系统发育的重要作用,并对表型进行了深入探索。 相似文献
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人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型是宫颈癌的主要诱因之一. HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18. HPV58中和单克隆抗体可用于 HPV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的 研究提供实验材料. 本研究采用HPV58 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞进行杂交瘤 细胞的制备,通过VLP-ELISA和假病毒中和实验筛选杂交瘤细胞株;经rProtein A纯化 阳性杂交瘤细胞培养上清获得单抗;采用ELISA测定型别特异性中和单抗的亲和力,采用相加实验及变性VLP-ELISA分析单抗识别表位的性质;选取高亲和力单抗建立定量分 析HPV58 L1 VLP的ELISA方法. 获得了2株HPV58特异性中和单抗XM-22和XM-23,亲和常数分别为2.7×107 mol-1·L和1.9×106 mol-1·L,二者识别表位可能不同. 同时获得2株具有交叉中和活性的单抗XM-21和XM-24,除可较高水平中和HPV58外,还可分别交叉 中和亲缘关系较远的HPV18和HPV6. 以XM-22建立的ELISA方法定量分析HPV58 L1 VLP的检测范围为0.05 μg/mL~0.40 μg/mL. 本研究建立的ELISA方法可用于HPV58 L1 VLP疫苗生产的质量控制研究,获得的4株具有不同特点的中和单抗可用于HPV58感染入侵机制 的研究. 相似文献
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CDK11 P58调节细胞增殖与凋亡机制 总被引:1,自引:1,他引:0
CDK11 P58属于CDK11/PITSLRE蛋白激酶家族成员,由Cdc2L1和Cdc2L2基因编码,通过使用内部核糖体进入位点(IRES)翻译而来.它在有丝分裂、凋亡、纺锤体形成、微管稳定肿瘤发生发展和中枢神经损伤等方面均有重要作用.目前发现,CDK11 P58能与HBO1、细胞周期蛋白D3、β-1,4-半乳糖转移酶、雌激素受体、雄激素受体等相互作用.进一步研究CDK11 P58的功能将为如肿瘤和代谢疾病的医治带来新的思路. 相似文献
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目的探讨1号染色体长臂(1q)的扩增对人胚胎干细胞(hESCs)神经分化的影响。 方法通过对H9 hESCs克隆化培养的方法获得1q扩增的hESCs系。中期染色体计数的方法明确细胞内的染色体数目,核型分析鉴定染色体变异的情况,全基因组测序(WGS)分析基因组片段拷贝数变异的情况。使用碱性磷酸酶(AP)染色法检测细胞干性维持的情况,RT-qPCR和免疫荧光染色等方法检测胚胎干细胞(ESCs)标志物OCT4、SOX2、NANOG、REX1和SSEA4等的表达。拟胚体(EB)形成实验进行hESCs不定向分化、全反式视黄酸(RA)诱导hESCs向外胚层分化、使用STEMdiff? SMADi Neural Induction Kit诱导hESCs向神经祖细胞(NPCs)定向分化,并通过RT-qPCR、AP染色和免疫荧光染色等方法检测其分化能力。两组间比较采用独立样本t检验。 结果分离获得一株1q发生2个拷贝扩增的细胞,核型分析发现额外获得的2个1q是等臂染色体,核型为[47,XX,+i (1q)],将其命名为Amp (1q)。Amp (1q)AP染色呈阳性,且表达ESCs标志物OCT4、SOX2、NANOG、REX1和SSEA4,具备干细胞自我更新的特征。EB分化过程中,与H9细胞相比,Amp (1q)向外胚层的分化能力下降,MAP2 (29.67±1.53比66.67±1.15)和PAX6 (8001±567.09比28308.00±1692.50)的表达降低(P均< 0.05);RA诱导分化实验进一步证明,与H9细胞相比,Amp (1q)存在向外胚层分化的缺陷,MAP2 (22.50±3.54比42.50±2.12)和PAX6 (5403.00±569.93比38756.00±1068.44)的表达降低(P均< 0.05)。当定向诱导向神经谱系分化时,Amp (1q)形成NPCs的能力降低,NPCs标志物PAX6的表达水平低于H9细胞(13.83±3.75比88.33±1.53) (P均< 0.05)。 结论Amp (1q)具有ESCs自我更新的能力,但1q的扩增会削弱hESCs神经分化的能力。 相似文献
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摘要 目的:研究模拟海拔5000 m低压低氧环境下,不同低氧暴露时间对小鼠肠道组织结构、免疫因子和肠道菌群的影响。方法:采用低压低氧舱模拟海拔5000 m高度,构建8周龄雄性C57BL/6小鼠低氧模型,随机分为1、3、5、7、14和30 d低氧组及其常氧对照组,每组6只常规饲养,记录体重。在对应时间点取材,HE染色制作小鼠回肠组织切片、免疫组织化学染色分析小鼠肠道紧密连接occludin蛋白表达,ELISA检测小鼠血浆免疫因子IL-6、IL-22和TNF-α水平,16S rDNA测序分析肠道菌群变化。结果:与常氧对照组相比,各低氧组小鼠体重均显著降低(P<0.05)。小鼠回肠组织HE 染色及免疫组化染色显示,各低氧组均出现不同程度的肠上皮绒毛缺损,淋巴细胞增多等变化,且7、14 d组低氧组小鼠紧密连接occludin蛋白表达量显著降低(P<0.05)。与常氧组相比,7 d低氧组小鼠血浆IL-6水平显著降低(P<0.05),14 d低氧组小鼠血浆IL-6水平显著增加(P<0.05);与相应的常氧组对比,低氧组TNF-α和IL-22的水平没有显著差异,但在各低氧组间出现差异。不同低氧时间组与其常氧对照组的肠道菌群构成具有显著差异;在菌属水平上,低氧组中普雷沃菌属(Prevotella)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、颤螺菌属(Oscillospira)、拟杆菌属(Bacteroides)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和臭气杆菌属(Odoribacter),相对丰度较高且具有显著性差异(P<0.05);血浆免疫因子与肠道菌群相关分析表明,乳酸杆菌属(Lactobacillus)与IL-6、IL-22水平呈显著正相关(r=0.27,P<0.05;r=0.27,P<0.05)。结论:模拟海拔5000 m低压低氧环境显著改变C57BL/6小鼠肠道组织结构及其屏障功能和肠道菌群组成,肠道菌群的变化与免疫因子水平显著相关,这些变化与低氧暴露时间相关,是小鼠低氧应激响应肠道功能的适应性变化。 相似文献
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真核生物中锌指蛋白的结构与功能 总被引:3,自引:0,他引:3
真核生物中的许多蛋白质分子包含锌指结构区,这类蛋白称为锌指蛋白.锌指蛋白因其包含特殊的指状结构,在对DNA、蛋白质和RNA的识别和结合中起重要作用.许多锌指蛋白的锌指结构域包含能与DNA特异结合的区域,并与某些效应结构域(如KRAB、SCAN、BTB/POZ、SNAG、SANT和PLAG等)相连,这类锌指蛋白常作为转录因子起作用,可调控靶基因的转录.一些锌指蛋白包含蛋白质识别结构域(如LIM锌指、MYND锌指、PHD锌指和RING锌指等),它们能够特异地介导蛋白质之间的相互作用,因此被称作蛋白适配器.此外,某些锌指蛋白还可以结合RNA,起转录后调控作用.本文就锌指蛋白与DNA、RNA以及蛋白质分子间的相互作用作一综述. 相似文献
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为探讨心钠素基因转移治疗高血压和慢性心肾功能衰竭等慢性疾病的潜力,首先利用逆转录病毒载体获得可表达和分泌人心钠素的遗传工程细胞,然后将这种细胞植于自发性高血压大鼠SHR的皮下。结果发现,人心钠素遗传工程细胞的移植可使动物血浆中的心钠素浓度在移植后第7天时明显升高。在整个实验期间,虽然实验组动物的血压会随个体发育而逐渐升高,但在实验开始后的42 d内却始终明显低于空载体组,其中第14天血压的差异高达33 mm Hg。在实验开始后的第14天和第21天,实验组动物的尿量也明显增加。以上结果说明,人心钠素遗传工程细胞的皮下移植可明显抑制SHR大鼠血压的上升趋势和改善其泌尿功能,提示该方法具有治疗高血压和慢性心肾功能衰竭等慢性疾病的潜力。 相似文献
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目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏茵鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV18L2N(aa.13—154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达F1ic突变体与HPV18L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV18L2疫苗奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliCD3区域(fliCAD3)、D3+CD2a区域(fliCAD3CD2a)、D3+D2区域(fliCAD2D3)的突变体,同时将HPV18L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS—PAGE及Westernblot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni—Sepharose亲和层祈纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native—PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果:构建了pET22b.fliCAD3/18L2N、pET22b—nic△D3cD2a/18L2N、pET22b—fliCAD2D3/18L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV18L2N的融合蛋白,为增强HPVL2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV18L2疫苗奠定了基础。 相似文献
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目的:通过定点突变,构建集成干扰素(IIFN/165S),以期获得高效的新型药物分子.方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素IIFN基因的第165位密码子由CGT突变为AGT.扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).在LB培养基中培养,经IPTG诱导表达的IIFN/165S经包涵体变性、复性以及层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析,用WISH-VSV系统进行抗病毒活性测定同时应用流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:IIFN/165S以包涵体形式表达.纯化后,IIFN/165S的纯度大于95%,分子量为18172,比活性(7.63±0.22)×108 IU/mg,诱导细胞凋亡率呈剂量依赖.结论:构建了IIFN/165S的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高纯度高活性突变分子IIFN/165S. 相似文献